HSV病毒可从气管支气管分泌物、支气管肺泡灌洗液、肺组织中获得。采用纤维支气管镜收集标本应早期进行。经皮细针抽吸肺活检和开胸肺活检无多大帮助。皮肤黏膜损害囊泡液体中病毒的最高分离率为80%～98%，当溃疡结痂和愈合分离率则下降(<25%)。标本的收集和运送在分离病毒过程中相当重要。标本应尽快收集，因为在疾病进展后分离到病毒的可能性减少。收集标本后及时接种，可能有较高的病毒分离率。必须注意运送和储存标本的条件，在正式检测前，标本不能放在-20℃的冰箱中冷冻;运送过程中标本可保存4℃ 48h。
HSV感染的实验室诊断应从两方面评价：首先，确定病人是否正在排放病毒，有无存在HSV现行感染以进行积极的抗病毒治疗。其次，在可疑患者病毒重新激活出现临床症状前，确定病人血清抗体是否阳性，以检查过去是否感染HSV，以确定在骨髓移植、器官移植、诱导化疗前有无必要进行预防性抗病毒治疗。
1.细胞培养 组织培养为最敏感和特异的诊断方法，亦可用于病毒的分型。在病毒高滴度的标本，24～48h内可获得阳性结果，接种后72h内在90%的培养基中可产生特征性的细胞病变效应;而在低滴度的标本，7天后方可看到特征性变化。然而，组织培养并不能始终确立病毒的存在，这是因为标本的收集和运送欠妥以及使用抗病毒药可能出现假阴性。
2.检测病毒
(1)Papanicolaou(Pap)或Tzank试验：是快速、便宜的细胞诊断方法，先进行病变部位的刮片细胞染色，能在20min内显示细胞改变，即多核巨细胞形成、胞质空泡样变和包涵体。阳性涂片结果可靠，但不能区分水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)和HSV-1或HSV-2。阴性涂片亦不能排除疱疹病毒感染。在理想情况下，Tzanck涂片约50%阳性，其敏感性和特异性均较低，且依靠检测者经验;由于许多技术和实际原因，应用受限。
(2)单克隆抗体间接免疫荧光染色检查：用于病灶刮片检查，敏感度为78%～88%，假阳性少见。直接电子显微镜检查很诱人，因为可在2h内完成，但敏感性多变，特异性低。酶联免疫吸附试验用于单纯疱疹病毒的检查，敏感度可达95%，特异性高，但标本收集后如不立即检查其敏感度下降。亦有采用放射免疫分析法检查单纯疱疹病毒。荧光素标记抗体试验、间接免疫过氧化物酶试验或使用单克隆抗体的酶免疫分析法等，这些方法价格低廉，快速，不需要细胞培养技术。新近产生的用单克隆抗体进行直接荧光素标记抗体染色的离心技术快速敏感，但更常用于巨细胞病毒的诊断。使用免疫荧光直接检测HSV抗原，特异性高但敏感性差，且依靠标本质量。
酶免疫测定法(EIA)测HSV抗原，有培养放大技术和直接检测技术，研究结果显示：HSV EIA对各种来源的标本高度敏感(93.7%)，高度特异(96.6%);方法简单，重复性好，快速(4h)，标本受细菌污染时影响结果，已治愈或正在进行抗病毒治疗的病人结果不可靠。气管支气管标本和下呼吸道分泌物的病毒培养，阳性结果通常需2～5天，但阴性结果需2周才能确定。
(3)DNA探针技术的应用：DNA探针有助于HSV感染的诊断。DNA探针在细胞形态学可疑时能确定诊断。几种因素能混淆形态学诊断：①HSV包涵体与巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和腺病毒(adenovirus)的包涵体相似。②发生HSV和CMV双重感染时。③除了HSV其他呼吸道病毒也能产生多核细胞。原位杂交使特殊病毒基因组序列定位，它比传统的确定方法简单快速。
(4)聚合酶链反应技术(PCR)：PCR对HSV病毒感染可提供结论性依据，即使在石蜡包埋组织只要有一致的病毒病理改变即可。每次检查必须有阴性对照组织。尽管存在隐性感染的可能性，但对没有病毒病理改变的对照组织，PCR检查HSV仍为阴性。如进行合适的对照，该方法快速(1天内完成)，准确特异，敏感性高，能对陈旧或复杂的标本进行处理。PCR和HSV培养结果近似，PCR没有Tzanck涂片和病毒培养的许多技术和实际限制，PCR在快速诊断可疑HSV病毒感染的免疫抑制病人显示其优越性。
3.血清学检查 该方法的最大价值是证明病人已经感染过HSV，血循环中的抗HSV抗体是存在反复感染可能的标志。抗体滴度增加4倍或更多提示HSV的近期感染。HSV抗体可通过许多方法检测，包括补体结合试验，微量中和试验和酶免疫分析法。这些方法高度敏感和可靠，但血清学检查不能区分内源性病毒感染和重新感染。血清学检查结果无诊断意义，无助于快速诊断。另一问题为HSV-1和HSV的交叉反应，故不能确定HSV急性感染的血清分型。仅仅在急性期血清中无HSV抗体时，血清学检查可用于诊断HSV初次感染，在这种情况下，如果恢复期血清中抗体出现，可称为血清转阳现象(seroconversion)。HSV肺炎时抗体滴度不增高常提示预后较差，病毒容易广泛播散。
4.病毒分型 常用3种方法为单纯疱疹病毒分型。首先采用和标准的方法为限制性内切核酸酶切割，并经琼脂凝胶电泳分离，HSV-1和HSV-2的DNA类型不同，据此很容易鉴别HSV-1和HSV-2。第2种方法为用荧光素标记的特异性单克隆抗体进行病毒的分型，该方法具有对切片和培养基进行快速和直接检测的优点。第3种方法为使用溴乙烯去氧苷(5-bromovinyldeoxyuridine，BrdU)，该物质在细胞培养基保持适当浓度仅可阻滞HSV-1复制。HSV血清分型对于流行病学很重要，临床医生很少需要这种信息，HSV生殖道感染和HSV脑炎例外。
对于非致命性HSV感染，可进行病毒培养的实验室检查，因为这种感染常常临床上即可鉴别，提取标本后数天内可获得病毒确认。而对于致命性HSV感染，须进行立即抗病毒治疗，所以必须进行快速准确的HSV感染的诊断。最好的方法为免疫荧光染色。严重HSV感染患者早期进行抗病毒治疗有较好的预后。虽然在确诊之前可进行抗病毒治疗，但快速的阳性检查结果能促使医生尽早开始抗病毒治疗。新生儿HSV严重感染患者可能仅有皮肤损害作为HSV感染的证据，快速诊断检查尤为重要，如耽误了诊断和治疗，将很快发生其他部位的播散，预后将明显恶化。在无症状的HSV感染病人，不能过分强调进行HSV快速诊断试验。
X线胸片与其他肺部感染较难鉴别。可显示局限性、多发性或弥漫性间质浸润，早期可有典型的肺门或弥漫性间质密度增加，支气管壁增厚，随着病情进展可见斑片状肺泡填塞。单纯疱疹病毒性气管支气管炎胸片可正常。
