1.涂片染色检查 可从溃疡边缘深部或基底部取材，先用生理盐水洗净患部，取其渗出物。如为淋巴结穿刺取材，应从健康皮肤处进针，以免形成瘘管。涂片时应从玻片的一端推向另一端，以保持细菌的特征形态。涂片固定后可用Gram、Wright、Giemsa或Pappenheim Saathof染色。约50%可查见长约1～2cm末端钝圆的二极染色的短小杆菌，Gram染色阴性，单个或沿黏液丝方向呈团状或平行排列小群聚集。溃疡处常有与Ducrey嗜血杆菌相似的短小杆菌污染，但污染菌无“鱼群样”特征。
2.病原菌培养 可从横痃或溃疡损害处取材。常用培养基为淋球菌胎牛血清培养基、Mueller-Hinton巧克力培养基等。2h内接种，置于5%～10%二氧化碳和饱和湿度环境中，于33～34℃至少培养48h。Ducrey嗜血杆菌的菌落直径为2mm，呈光滑的半球形，黏性极强。
3.鉴定试验 对已分离出的Ducrey杆菌，应进行生化试验进行鉴定，有氧化酶试验和硝酸盐还原试验等。
4.免疫学检查 间接免疫荧光试验以与Ducrey杆菌外膜成分起反应的单克隆抗体检测生殖器溃疡分泌物涂片。酶免疫试验在培养阳性的本病患者中检出率为93%，可用于大规模人群的筛选检查。
5.分子生物学检查 有核酸杂交技术和核酸扩增技术等，后者又分为PCR和LCR。32P标记的DNA探针已用于鉴定培养中的Ducrey杆菌。用PCR技术检测生殖器溃疡中的Ducrey杆菌对本病的诊断有一定价值，但也存在不少问题。
组织病理检查：
1.皮肤溃疡 显示3个层带，典型者有诊断意义。
(1)浅层：即基底，较狭窄，由中性粒细胞、红细胞、纤维蛋白和坏死组织组成。用Giemsa或Gram染色可检出Ducrey嗜血杆菌。
(2)中层：较宽，有多数新生血管形成，血管内皮细胞显著增生，可导致血管腔闭塞，有血栓形成和继发性坏死。浅层和中层间可见有水肿。
(3)深层：主要为成纤维细胞增生，淋巴细胞和浆细胞密集浸润。
2.受累淋巴结 呈重度急性炎症反应，有中性粒细胞浸润及坏死。
